引物设计有3条基本原则:首先引物与模板的序列要紧密互补;其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构;再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。 设计软件一般推荐：primer5/snapgene/Oligo引物设计的一般规则：
（1）长度尽量选取：18-30bp
（2）碱基尽可能随机分布，G+C＝45-65%
（3）Tm = 55℃-68℃
（4）引物序列与非扩增区域无同源性
（5）5’末端碱基，无严格限制，3’末端要求严格配对
（6）在引物内, 尤其在3'端应不存在二级结构。 两引物之间尤其在3'端不能互补, 以防出现引物二聚体
（7）引物5'端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时在5’端加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等
（8）引物3’端碱基必须严格配对， 引物3’端出现连续三个的以上的连续碱基，如GGG、CCC，容易使错误引发几率增加